在生物学实验中,同一抗体在不同条件下进行电泳等分析时,跑出来的分子量却不一样,常常会出现这样的事情。有以下几个方面因素:
抗体本身的结构特点
抗体是具有4条多肽链的对称结构,包含2条较长、相对分子量较大的相同重链(H链)和2条较短、相对分子量较小的相同轻链(L链),链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子 。抗体存在多种形式,除了常见的单体形式,还可以形成多聚体。比如,IgM抗体在体内通常以五聚体形式存在,而在某些实验条件下,其聚合状态可能发生改变,从五聚体解离成单体或其他聚合程度不同的形式。这种聚合状态的变化会直接影响其在电泳等分析中的迁移率,从而表现出不同的分子量。
2.翻译后修饰也会影响抗体分子量
抗体在细胞内合成后,会经历一系列的翻译后修饰过程,其中糖基化最为常见。不同的细胞表达系统,由于其自身的糖基化酶种类、活性以及细胞内环境等因素的差异,会导致抗体糖基化程度不同。
以在哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的同一抗体为例,哺乳动物细胞表达的抗体可能具有更复杂、多样化的糖基化修饰,而昆虫细胞表达的抗体糖基化程度相对较低。糖基化的差异会使抗体的分子量增加不同的程度,进而在电泳等实验中呈现出不同的分子量结果。此外,磷酸化、乙酰化等其他翻译后修饰方式,也在一定程度上改变抗体的电荷性质和分子大小,影响其在电场中的迁移行为,造成分子量测定的差异。
3.实验条件不同
3.1电泳缓冲液的成分和pH值对抗体的迁移有显著影响:不同的缓冲液配方会影响抗体分子所带的电荷数量和性质。例如,在pH值较高的缓冲液中,抗体分子带有更多的负电荷,迁移速度相对较快;而在pH值较低的缓冲液中,电荷数量和性质的改变使迁移速度发生变化,最终导致分子量测定结果出现偏差。
3.2样品处理过程:在制备样品时,还原剂的使用与否以及其浓度会影响抗体分子间二硫键的状态。如果二硫键没有被充分还原,抗体会以多聚体或部分折叠的形式存在,导致迁移异常。同时,样品的上样量如果过大,会造成电泳条带的扩散和拖尾现象,影响对分子量的准确判断。
3.3 凝胶的浓度和交联度也会对抗体的迁移产生影响:不同浓度的凝胶孔径大小不同,抗体在不同孔径的凝胶中迁移的阻力不同。一般来说,较高浓度的凝胶孔径较小,适合分离分子量较小的蛋白质或抗体;而较低浓度的凝胶孔径较大,更有利于分子量较大的抗体迁移。如果在实验中选择了不合适的凝胶浓度,就导致抗体迁移异常,出现分子量测定不准确的情况。
3.4 仪器设备的差异以及校准情况:不同品牌和型号的电泳仪、成像系统等设备,其性能参数和分辨率存在差异。而且,如果仪器没有定期进行校准和维护,也会影响实验结果的准确性,使得同一抗体在不同设备上跑出不同的分子量。
在进行实验时,我们需要充分考虑这些因素,尽可能优化实验条件,准确分析实验结果,以获得可靠的抗体分子量数据。